科研 | Aging：基于机器学习的动态代谢分析揭示大鼠尿液中衰老相关标志物（国人佳作）

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编译：微科盟红烧大肥鸥，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

衰老和新陈代谢过程是紧密交织在一起的；因此，开发与新陈代谢相关的生物标志物是延缓衰老的关键。然而，很少有基于机器学习的研究能发现衰老轨迹的可靠标记物。我们利用超高效液相色谱/质谱技术从大鼠尿液中生成代谢谱，而代谢谱是在训练组和试验组大鼠年龄的四个阶段(20、50、75和100周)动态生成的。偏最小二乘判别分析得分曲线图表明训练组和测试组随着年龄的增长，在一个方向上呈现出完美的分离轨迹。在训练组中，我们通过结合四种算法(VIP、时间序列、LASSO和SVM-RFE)进一步筛选出25个与衰老相关的生物标志物。本研究最后鉴定出6种与衰老相关的代谢物（已知或新的），包括肾上腺素、戊二酰肉碱、L-犬尿氨酸、牛磺酸、3-羟基十二碳二酸和N-乙酰瓜氨酸。我们还发现除N-乙酰瓜氨酸外(p<0.05)，100周时无瘤大鼠和荷瘤大鼠之间与衰老相关的代谢物没有差异(p>0.05)。我们的发现揭示了衰老的代谢轨迹，并为潜在的抗衰老治疗靶点提供了新的生物标志物。

论文ID

原名：Aging-related markers in rat urine revealed by dynamic metabolic

profiling using machine learning

译名：基于机器学习的动态代谢分析揭示大鼠尿液中衰老相关标志物
期刊：Aging
IF：4.831发表时间：2021.05通讯作者：牛玉存
通讯作者单位：哈尔滨医科大学

实验设计

实验结果

1. 食物摄入量、体重和尿液代谢与衰老的关系
在本研究中，训练组包括60只雄性Wistar大鼠，试验组包括30只雄性Wistar大鼠。他们从8周开始被喂食颗粒状食物，训练组和试验组大鼠随年龄增长的摄食量和体重轨迹如图1A和1B所示。训练组和试验组的食物摄入量都随着年龄的增长而波动(图1A)。训练组前58周体重随年龄增长而增加，然后慢慢稳定下来，从93周开始下降(图1B)。这种下降趋势随着年龄的增长而持续(数据未显示)，表明这些大鼠进入了脆弱状态。试验组也观察到了类似的结果(图1B)。此外，在100周时，共有43只大鼠自然死亡(数据未显示)，进一步表明这些大鼠在100周时进入衰老阶段。与试验组相比，训练组的平均摄食量较低(p<0.05)，但体重无统计学差异(p>0.05)(图1A和1B)。图1 食物的摄入量，体重，基峰强度色谱图和随年龄增长的尿液代谢曲线
（A）训练组和测试组的食物摄入量。（初始样本量：训练组n= 60；测试组n = 30）。（B）训练组和测试组的体重。（初始样本量：训练组n = 60；测试组n = 30）。训练组大鼠在(C)25周、(D)50周、(E)75周、(F)100周的负离子电喷雾电离 (ESI-)模式下，获得具有代表性的基峰强度色谱图（BPI）。UPLC-Q-TOF-MS测得的尿液PLS-DA积分图(G)左为阴性，(H)右为阳性。(每个时间点n=24)。 在研究期间，我们对动态采集的训练组大鼠尿液进行代谢组学分析，并采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测。我们进行了主成分分析，包括正负离子模式下质量控制样本（QC）和训练组时间数据的实验样品。图1C-1F显示了四个时间点的代表性基峰强度色谱图。本研究使用训练组原始数据的“80%规则”过滤标准，并导出了负离子模式下的10729个代谢物列表和正离子模式下的27962个代谢物列表，用于随后的多变量统计分析。基于所有代谢物电喷雾电离（ESI+和ESI−）所得到的偏最小二乘判别分析得分曲线图显示了一个方向、不同时间点和随年龄增长的完美分离轨迹(图1G和1H)。总而言之，这些结果表明在衰老过程中会发生代谢重塑，导致尿液代谢物的改变。
2. 基于时间序列分析的代谢物老化轨迹
为了动态识别与年龄相关的代谢轨迹，我们进行了时间序列分析，并根据负模式和正模式下的代谢物老化轨迹预定义了九个簇(图2A)。考虑到尽可能多与年龄相关的代谢物，我们选择了负离子模式下包含60.8%代谢物的第1、3、5、7、8和9组，以及正离子模式下第3、4、7和8组中71%的代谢物，因为这些簇往往表现出与年龄相关的代谢物增加或减少，且这些代谢物可能对衰老敏感。图2 在训练组中采用负离子模式并结合时间序列分析和变量重要性投影值(VIP)筛选代谢物
(A)代谢衰老轨迹。所有10729种代谢物丰度的模糊c均值聚类。集群的平均趋势用黑线表示。(B)25周和100周大鼠尿液PLS-DA积分图。(ESI−，R2=0.881，Q2=0.8)。(每个时间点n=24)。(C)PLS-DA得分图2个主成分的排列检验。(D)维恩图结合两种算法显示出代谢物的重叠。
为了进一步缩小与年龄相关的代谢物范围，本研究针对ESI-和ESI +模式绘制了两个时间点（25周和100周）之间的PLS-DA得分。图2B显示了两个时间点之间的清晰分隔，并已通过置换测试得到了验证，这反映在左边的所有R2X和Q2值都低于最左边的原始点（图2C）。根据PLS-DA得分下的VIP值（VIP> 1.0）我们共选择了ESI-模式下的1251种代谢物和ESI +模式下的2907种代谢物，其中ESI-模式下的1091种和ESI +模式下的1559种代谢物与时间序列数据重叠（图2D）。接下来，我们试图确定尿液代谢物图谱是否存在保守的变化，并在试验组中进行了平行分析。使用测试组原始数据的“80%规则”过滤标准，我们得出了9008个负离子模式代谢物和24951个正离子模式代谢物的列表，用于随后的多变量统计分析。
3. 基于机器学习的衰老相关代谢物筛选
考虑到数据具有小样本和高维的特点，接下来我们基于1091种代谢物(在ESI−模式下)或1559种代谢物(在ESI+模式下)，结合两种不同的机器学习算法来选择与衰老相关的代谢物，用于分类25周和100周。首先，我们使用LASSO算法来缩小训练队列中与衰老相关的代谢物范围(图3A)。对于LASSO惩罚回归模型，我们通过寻找分类误差最小的λ来确定变量。本研究共筛选出14种代谢物（ESI−模式）和16种的代谢物（ESI+模式）。我们还应用了SVM-RFE算法来选择与衰老相关的代谢物(图3B)。SVM-RFE算法根据SVM分类器计算出的特征值逐个剔除变量来选择特征代谢物。为了获得这两种方法交叉生成的更多数据，我们根据ESI−或ESI+模式下的特征值选择了排名前300种的代谢物，结合LASSO和SVMRFE算法，联合鉴定了300种与衰老相关的代谢物（ESI−模式）和305种与衰老相关的代谢物（ESI+模式），其中14种ESI−模式和11种ESI+模式代谢物作为候选代谢物并被两种算法同时选择(图3C)。此外，我们使用受试者工作特征曲线分析，将这些候选代谢物应用于预测测试队列中的衰老状态。我们发现这些代谢物在测试队列中很好地区分了年轻和老年状态，并且ESI−或ESI+模式下其曲线下面积为1(图3D)，这表明这25种候选代谢物可能是很好的衰老预测指标。热图显示了25种候选代谢物(图3E)，反映了旧阶段代谢的剧烈变化。图3 在负离子模式下采用两种基于机器学习的特征选择算法
(A)训练组中的最小绝对值收敛和选择因子(LASSO)算法。(B)训练组采用支持向量机递归特征消除(SVMRFE)算法。(C)维恩图结合两种算法显示了代谢物的重叠。(D)用受试者工作特征(ROC)曲线分析对训练组检测到的14种候选代谢物进行了验证。(E)对训练组中同时从LASSO算法和SVM-RFE算法中选择25种正负离子模式下的代谢物进行聚类分析。
4. 衰老相关生物标志物的鉴定
本研究利用MassFragment软件对25个与衰老相关的候选代谢物保留时间、精确质量和串联质谱碎片图谱与标准品进行了比较，从而确定了这些候选代谢物。本研究共鉴定出6种代谢物(表1)，这些代谢物在正负两种模式下的丰度如图4A-4L所示。在训练和测试队列中，25周龄大鼠的肾上腺素和戊二酰肉碱水平显著高于100周龄大鼠，而25周龄大鼠的L-犬尿氨酸、N-乙酰瓜氨酸、牛磺酸和3-羟基十二烷二酸水平显著低于100周龄大鼠(图4A-4L)。在训练和测试队列中，25周龄大鼠的肾上腺素和戊二酰肉碱水平显著高于100周龄大鼠，而L-犬尿氨酸、N-乙酰瓜氨酸、牛磺酸和3-羟基十二烷二酸则显著低于100周龄大鼠(图4A-4L)。特别值得注意的是，我们发现这些已鉴定的代谢物在负离子模式下位于第8或9簇，在阳离子模式下位于第3或4簇(表1)，表明这些已鉴定的代谢物可能是反映衰老轨迹的可靠生物标志物。表1 正负离子模式下鉴定的尿液生物标志物
图4 随着年龄的增长，六个潜在生物标志物丰度的小提琴图
X轴上的1、2、3和4分别表示为20周、25周、50周、75周和100周。(A-F)试验组正负离子模式下的代谢物归一化丰度图，包括(A)肾上腺素、(B)戊二酰肉碱、(C)L-犬尿氨酸、(D)N-乙酰瓜氨酸、(E)牛磺酸和(F)3-羟基十二烷二酸(3OHDC12)。(G-L)训练组正负离子模式下代谢物的归一化丰度图包括(G)肾上腺素(H)戊二酰肉碱、(I)L-犬尿氨酸、(J)N-乙酰瓜氨酸、(K)牛磺酸和(L)3-羟基十二烷二酸(3OHDC12)，(G)肾上腺素(H)戊二酰肉碱、(I)L-犬尿氨酸、(J)N-乙酰瓜氨酸、(K)牛磺酸和(L)3-羟基十二烷二酸(3OHDC12)。（对于测试组和训练组中的6个候选代谢物，在25周和100周之间进行比较，P <0.0001；单因素方差分析）。
5. 衰老相关的生物标志物与大鼠肿瘤的发生
鉴于我们观察到许多大鼠在长期喂养期间携带自发性肿瘤(表2)，确定衰老和肿瘤之间是否存在机制联系是很有趣的。虽然在25周龄的大鼠中我们没有发现肿瘤，但一些大鼠在25周后出现了肿瘤。因此，我们首先选择了25周龄的大鼠来探讨衰老相关的代谢物与未来肿瘤发生(预测肿瘤)之间的关系。肾上腺素、戊二酰肉碱、L-犬尿氨酸、牛磺酸和N-乙酰瓜氨酸在无肿瘤大鼠和有肿瘤大鼠之间没有差异，而有肿瘤大鼠的3-羟基十二烷二酸水平高于无肿瘤大鼠(图5A-5F)。为了进一步研究衰老相关代谢物对肿瘤的潜在贡献，我们对100周龄的大鼠进行了分析。并发现与无肿瘤大鼠相比，有肿瘤大鼠肾上腺素、戊二酰肉碱、L-犬尿氨酸、牛磺酸和3-羟基十二烷二酸水平无明显差异，但N-乙酰瓜氨酸水平明显升高(图5G-5L)。图5 无肿瘤大鼠与预测的肿瘤大鼠之间6种潜在生物标志物丰度的小提琴图
在25周时，X轴上的0和1分别代表无肿瘤大鼠和有肿瘤大鼠。在100周时，X轴上的0和1分别代表无肿瘤大鼠和有肿瘤大鼠。(A-F)是25周时正负离子代谢物的标准丰度图，包括(A)肾上腺素、(B)戊二酰肉碱、(C)L-犬尿氨酸、(D)N乙酰瓜氨酸、(E)牛磺酸和(F)3-羟基十二烷二酸(3OHDC12)。(G-L)100周时正负离子模式下代谢物的归一化丰度图，(G)肾上腺素(H)戊二酰肉碱、(I)L-犬尿氨酸、(J)N-乙酰瓜氨酸、(K)牛磺酸和(L)3-羟基十二烷二酸(3OHDC12) (P<0.05被认为具有统计学意义；t检验)。 表2 由兽医病理学家确定的大鼠肿瘤病理分类

讨论

多项研究试图确定影响寿命的遗传和代谢因素。在前人工作的基础上，在本研究中我们使用高性能LC/MS对训练队列中随年龄增长的尿液代谢物进行了动态检测，并结合VIP、时间序列、LASSO和SVM-RFE等四种算法选择了25种与衰老相关的候选代谢物。我们使用测试队列进一步验证了候选代谢物，在测试队列中，这些代谢物可以将测试数据分层为年轻或年老的两个不同的亚组。最后，我们从25个候选者中确定了6种代谢物，其中一些以前与衰老无关，这为对抗衰老的潜在途径提供了一个新的视角。此外，我们评估了衰老相关代谢物与诱发肿瘤之间的关联。为了深入了解代谢和衰老的潜在机制并确定延缓衰老的目标，鉴定与衰老相关的可靠生物标记可能是一种有效的策略。新兴的算法可能有助于发现生物标志物，尤其是机器学习，包括LASSO和SVM。事实上，许多研究已经将机器学习模型应用于疾病诊断和预后，以及标志物识别。Jiliang等人基于LASSO，Logistic回归和SVM-RFE算法发现，MSEH（一种基于三个CpG的信号）有利于早期肝细胞癌患者的复发预测。Liang等人使用机器学习将尿液代谢组学中的15种代谢物确定为肝癌标志物。此外，以前的研究应用机器学习和横截面数据揭示了健康成年人群中与年龄相关的代谢物。然而，机器学习在队列中动态筛选与衰老相关尿液代谢物的应用仍然缺乏。在这项研究中，我们建立了从成年早期到老年的两组大鼠模型。我们结合VIP、基于软聚类的时间序列分析、LASSO和SVM-RFE等多种算法，选择并鉴定出6种候选代谢物。值得注意的是，尽管在时间序列分析中设置了宽松的限制，但在ESI−模式下，我们发现6个已鉴定的与衰老相关的代谢物存在于第8和第9簇中，或者在ESI+模式中存在于第3和第4簇中，它们呈现出半U形或半抛物线形的衰老轨迹，其特征是随着年龄的增加而逐渐增加或减少。我们进一步发现，这六种代谢物的丰度在100周龄时明显高于或低于25周龄时，尽管我们在筛选过程中没有设定p值限制，这表明机器学习可能是传统p算法的替代性统计工具。与先前关于角膜牛磺酸水平随年龄下降的报道一致，我们也发现尿中牛磺酸水平随年龄增长而下降。牛磺酸，一种普遍存在的含硫氨基酸，具有调节线粒体，抑制线粒体ROS，抑制炎症的功能，表明其具有潜在的抗衰老功能。因此，牛磺酸转运蛋白基因敲除的小鼠表现出骨骼肌异常和骨骼肌的加速衰老的现象。此外，据报道，补充牛磺酸可以延缓与衰老相关的疾病，包括慢性心力衰竭、糖尿病和内皮功能障碍。其他与衰老相关的代谢物包括L-犬尿氨酸，它是色氨酸的主要降解代谢物。抑制色氨酸转化为犬尿氨酸的过程可以延长寿命。先前的一项研究表明，血浆色氨酸/ L-犬尿氨酸比值随着年龄的增长而增加。相反，我们发现尿液中L-犬尿氨酸的丰度随着年龄的增长而降低。我们推测L-犬尿氨酸的减少可能是由于色氨酸随年龄的下降而引起的，这表明色氨酸/L-犬尿氨酸的比值可能比单独的L-犬尿氨酸是更有效的衰老相关标记指标。N-乙酰瓜氨酸是参与精氨酸合成途径的一种瓜氨酸代谢物。虽然寿命和乙酰瓜氨酸之间的因果关系尚未确定，但精氨酸合成途径被证明与长寿有关。补充精氨酸可激活DAF-16/FOXO或SKN-1/Nrf2应激反应通路来延长线虫的寿命。此外，细胞内补充精氨酸可提高T细胞的存活率，有利于抗肿瘤反应。肾上腺素是肾上腺髓质中的主要荷尔蒙。虽然肾上腺素与长寿相关的证据较少，但大量研究表明，肾上腺素在增强记忆力，调节血压和降低血糖方面具有重要作用。其他代谢物，包括戊二酰肉碱和3-羟基十二烷二酸，与衰老之间的关系以前还未确定。戊二酰肉碱由戊二酰辅酶A和肉碱结合而成，参与蛋白质的生物合成。3-羟基十二烷二酸是一种被称为中链脂肪酸的有机化合物。目前对戊二酰肉碱和3-羟基十二烷二酸的研究主要集中在其与I型戊二酸尿症和脂肪酸氧化紊乱的关系。戊二酰肉碱与3-羟基十二烷二酸代谢和寿命的关系有待进一步研究。因为肿瘤与衰老密切相关，在生命过程中延迟肿瘤的发生似乎非常有利于长寿。因此，我们还评估了已鉴定的与衰老相关的代谢物与诱发肿瘤的关系。在6种候选代谢物中，我们发现与无肿瘤大鼠相比，预测性肿瘤大鼠的3-羟基十二烷二酸和N-乙酰瓜氨酸水平分别在25周和100周时升高。N-乙酰瓜氨酸已被证明与乳腺癌和前列腺癌的发病率密切相关。值得注意的是，我们观察到3-羟基十二烷二酸在25周时与预测性肿瘤的发生有关，但在100周时与肿瘤发生无关，这意味着3-羟基十二烷二酸可能不适合肿瘤诊断。此外有趣的是，与肿瘤大鼠的增加相反，3-羟基十二烷二酸和乙酰瓜氨酸随着年龄的增长而减少，这表明肿瘤的衰老具有复杂性。由于特定的代谢微环境和生物代谢过程不同，因此我们有理由推测大多数衰老相关标志物均独立于自发性肿瘤，尽管本研究中某些衰老相关标志物可能会受到肿瘤的影响。我们的研究有几个局限性。在这项实验中我们只对男性进行了调查，尽管已知性别与衰老和代谢稳态的不同反应有关。此外，我们发现了6种与衰老相关的代谢物，这些代谢物尚未在人类样本中得到验证；因此，我们的观察结果应该是生成假设并只提供了这些生物标记物在人类中的潜在应用。在不同年龄和性别的人群中进一步研究这些候选代谢物是有必要的。总而言之，我们在两次长期的大鼠实验中，结合不同的算法和应用的机器学习方法，筛选出了6种代谢物，这些代谢物是已知的或新的衰老相关标志物。这些发现可能为预测衰老和靶向抗衰老剂研发铺平了道路。我们需要进一步的研究以确认这些代谢物和衰老的潜在机制。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34016789/

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